5-NT 小鼠5核苷酸酶ELISA检测试剂盒说明书

【中文名称】：5-NT 小鼠5核苷酸酶ELISA检测试剂盒

【英文名称】：5-NT ELISA Kit

【产品规格】：96T/48T。

【保存条件】：2-8℃低温保存

【保质期】：6个月，所有试剂盒均提供批次。

检测原理：采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验，预先包被5-NT捕获抗体的微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，温育后洗涤，底物TMB显色，颜色深浅与样本中5-NT含量呈正相关。

适用范围：仅用于科研实验，不得用于临床诊断；可检测样本包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等。

操作步骤

试剂准备

试剂盒从4℃冷藏环境取出后，室温平衡15~30分钟；未用完的板条立即装入密封袋，放回4℃干燥保存。

30倍浓缩洗涤液用蒸馏水按比例稀释（48T规格用20倍稀释），若浓缩液有结晶析出，可水浴加温助溶，不影响实验结果。

标准品稀释

酶标板设标准品孔10孔，按以下梯度稀释（最终各孔浓度分别为180ng/L、120ng/L、60ng/L、30ng/L、15ng/L，加样量均为50μl）：

第1、2孔加标准品100μl + 标准品稀释液50μl，混匀

从1、2孔各取100μl分别加入3、4孔，加稀释液50μl，混匀

从3、4孔各取50μl分别加入7、8孔，加稀释液50μl，混匀

从7、8孔各取50μl分别加入5、6孔，加稀释液50μl，混匀

从5、6孔各取50μl分别加入9、10孔，加稀释液50μl，混匀后各取50μl弃去。

加样

设空白孔、标准品孔、待测样品孔。

待测样品孔先加样品稀释液40μl，再加待测样品10μl（样本最终稀释度为5倍）。

孵育

用封板膜密封反应孔，37℃温育30分钟；温育期间避免温度波动，酶标板需平放防止液体溢出。

洗涤

揭掉封板膜，弃去孔内液体，每孔加满洗涤液，静置30秒后甩干，重复洗涤5次，每次甩干后在吸水纸上拍干，确保无残留液体；使用自动洗板机时每孔注入洗液350μL，浸泡1分钟后洗涤。

加酶

除空白孔外，每孔加入酶标试剂50μl。

二次孵育

重复步骤4的孵育操作。

二次洗涤

重复步骤5的洗涤操作。

显色

每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟，此时孔内溶液会由无色变为蓝色。

终止与读数

每孔加入终止液50μl，溶液由蓝色变为黄色，终止反应。

加终止液后15分钟内，以空白孔调零，用酶标仪在450nm波长处测定各孔OD值。

四、结果计算

以标准品浓度为横坐标、对应OD值为纵坐标，使用专业软件选择四参数方程拟合标准曲线，将样品OD值代入方程即可计算出对应浓度。样品需设置复孔/三孔，复孔变异系数应小于20%。

五、注意事项

加样需使用校准后的移液器，单次加样时间控制在5分钟内，样本量较多时推荐使用排枪，避免实验误差。

封板膜仅限一次性使用，不同样本、试剂需更换枪头，防止交叉污染。

底物B对光敏感，需避光保存，避免长时间暴露于自然光下。

所有样本、洗涤液和废弃物需按传染物处理；不同批号试剂盒组分不得混用。

若所有孔均无明显颜色，需检查试剂是否混淆、酶标物是否失活、是否遗漏操作步骤；若背景颜色过深，通常与洗涤不充分、试剂污染、显色时间过长有关。