小鼠elisa试剂盒使用说明书，抗原抗体检测操作详细步骤

 

　　一、实验前准备与试剂平衡

 

　　操作前将小鼠elisa试剂盒从冷藏环境取出，置于室温（18-25℃）平衡至少60分钟。此举可消除温差导致的微孔板边缘效应，确保反应温度均一。检查所有组分：预包被板条、检测抗体、酶标抗体、标准品、浓缩洗涤液、显色底物及终止液。使用去离子水（电阻率≥18.2MΩ·cm）按说明书比例稀释浓缩洗涤液，配制工作洗涤液。

 

　　二、标准品与样本处理

 

　　标准品按标签复溶后，使用样本稀释液进行梯度倍比稀释，通常设置7个浓度点加空白孔。冻干标准品需静置溶解后再混匀，避免剧烈振荡产生气泡。待测样本若为血清或血浆，应避免溶血、脂血及反复冻融；组织匀浆需离心取上清，颗粒物会堵塞微孔导致显色偏差。所有样本建议做复孔检测，并预估浓度范围，超出检测上限者需预先用稀释液适当稀释。

 

　　三、加样与孵育（抗原捕获）

 

　　1.加样：取出所需板条，设空白对照、标准品孔及样本孔。每孔加入对应标准品或样本，通常每孔100μL。加样时枪头垂直悬空滴加，避免接触孔底包被层，以防物理性破坏抗体吸附。

 

　　2.封板与孵育：使用封板膜密封，于37℃恒温孵育60-90分钟。此阶段样本中的目标抗原与孔底固相捕获抗体结合形成免疫复合物。

 

　　3.洗板：揭去封板膜，弃去孔内液体，在吸水纸上拍干。每孔加满洗涤液（约350μL），静置30秒后弃去，重复5次。洗涤不充分将导致非特异性背景升高，过度洗涤则可能削弱弱阳性信号。每次拍板应确保孔内无残余液面。

 

　　四、检测抗体结合

 

　　每孔加入酶标检测抗体工作液100μL（具体类型依据试剂盒设计），更换新封板膜，再次37℃孵育30-60分钟。该步骤使检测抗体与已捕获的抗原另一表位结合，形成“夹心”结构。孵育结束后，重复上述洗板程序5次。

 

　　五、酶结合物反应（若为独立步骤）

 

　　若检测抗体未直接偶联酶，需追加酶标亲和素或酶标二抗工作液。每孔100μL，37℃孵育30分钟。此步利用亲和素系统放大信号。孵育后务必严格洗涤6-7次，因游离酶结合物的残留是背景染色的主要来源。

 

　　六、显色与终止

 

　　每孔加入现配的显色底物溶液（如TMB）100μL，避光于37℃孵育15-20分钟。显色时间需根据标准品显色梯度动态观察——当最高浓度孔呈明显蓝色、而空白孔仍澄清时，立即每孔加入终止液50μL。终止液为酸性溶液，加液顺序需与显色顺序一致，使蓝色转为黄色并稳定30分钟内。

 

　　七、读板与结果计算

 

　　以空白孔调零，在450nm波长处测定各孔吸光度（OD值）。若使用双波长，参考波长设为630nm以校正板底光学偏差。以标准品浓度为横坐标、OD值为纵坐标，拟合四参数Logistic曲线（或线性回归）。将样本OD值代入方程计算浓度，若样本曾稀释，需乘以相应稀释系数。

 

　　八、关键质控要点

 

　　·每块板必须包含标准曲线，不得跨批次复用标准品。

 

　　·样本加样顺序应记录，保证孵育时间一致，首尾孔时间差不超过10分钟。

 

　　·洗涤液使用前检查是否结晶，结晶需温育复溶。

 

　　·终止液具有腐蚀性，操作时使用防护手套。

 

　　·显色后若背景孔OD值高于0.15，提示洗涤不足或试剂污染，该板数据应废弃。

 

　　遵循上述规程，可确保小鼠ELISA检测结果的准确性、可重复性与批内稳定性。操作全程应保持台面洁净，移液精准，并严格控制各步骤时间节点。